熒光分光光度計的原理和使用的注意事項

        熒光分光光度計是一種用于掃描液相熒光標記發(fā)出的熒光光譜的儀器。它可以提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等多種物理參數(shù)，從各個角度反映分子的鍵合和結(jié)構(gòu)。熒光分光光度計具有靈敏度高、選擇性強、樣品量小、方法簡單、工作曲線范圍寬等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學、藥學和藥理學、有機無機化學等領(lǐng)域。
        熒光分光光度計的工作原理：
        光源的氙弧燈發(fā)出的光通過光切割器使其成為斷續(xù)光，激發(fā)光單色器變成單色光，該光為熒光物質(zhì) 被測熒光物質(zhì)在激發(fā)光下的激發(fā)光輻照通過單色器變成單色熒光，然后照射到供試品使用的光電倍增管上，其產(chǎn)生的光電流被放大器放大。輸入到記錄儀，激發(fā)光單色儀和熒光單色儀的光柵由電機驅(qū)動的凸輪控制。在繪制熒光發(fā)射光譜時，將激發(fā)光單色儀的光柵固定在最合適的激發(fā)光波長上。 轉(zhuǎn)動熒光單色儀的凸輪，將各波長的熒光強度信號輸出到記錄儀，記錄的光譜即為發(fā)射光譜，簡稱熒光光譜。
        熒光分光光度計測試注意事項：
         ①樣品應(yīng)置于四面透光的石英比色皿（熒光池）中。如果是揮發(fā)性樣品，則應(yīng)使用堵塞的熒光池。
         ②在熒光分析中，為了獲得穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要預(yù)熱氙燈30分鐘左右。如果儀器的光源是閃爍的氙燈，預(yù)熱時間可以縮短到10分鐘左右。對于一些易對光敏感、易分解的熒光物質(zhì)，盡量使用波長長、光強低、短時照明。
         ③溫度變化會引起熒光強度的變化。一般來說，降低溫度有利于提高熒光量子產(chǎn)率，增加熒光強度。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異。大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎沒有影響。
         ④當熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時，溶液的pH值對熒光強度的影響很大。由于弱酸或弱堿處于不同的酸度，分子和離子的電離平衡會發(fā)生變化，熒光物質(zhì)的熒光強度會因其解離狀態(tài)而發(fā)生變化。
         ⑤熒光物質(zhì)分子與溶液中其他物質(zhì)分子的相互作用導致熒光強度下降。常見的熒光猝滅劑，如鹵離子、重金屬離子、O2、硝化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中溶解的氧也可使幾乎所有熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光消光。因此，在更嚴格的熒光實驗中必須去除 02。